V experimentoch PCR (polymerázová reťazová reakcia) sa balenie môže zdať jednoduché, ale priamo ovplyvňuje stabilitu činidla, ľahké použitie a spoľahlivé výsledky. Či už ukladanie a preprava laboratória - pripravené reagenty alebo komerčné premixy, zvládnutie správnych techník balenia PCR sa môže vyhnúť bežným chybám a zlepšiť experimentálnu účinnosť. Nižšie zdieľame praktické tipy na výber materiálu, stratégie obalov a podrobnosti o ukladaní.
I. Výber materiálov obalov: Priority kompatibility a ochrany
Reakcie PCR sú citlivé na teplotu, svetlo a kontaminanty, takže obalové materiály musia spĺňať tri kľúčové požiadavky: vzduchotesnosť, svetlo - a chemická inerta.
Pre odstredivky a platne PCR sa uprednostňujú polypropylén (pp) kvôli jeho vysokej priehľadnosti a dNázy/rNázy {{}} voľných vlastností {. 0.2 ml tenké {{}} PRC PCR skúmavky sú ideálne pre rýchly prenos tepla, zatiaľ čo 0,5 ml trubice sú lepšie vhodný pre uložené koncentrované činidlá. Pre 96 - PLATS PCR, odporúčame zvoliť sokrovaný dizajn (pre ľahkú robotickú manipuláciu) alebo neskirtovaný dizajn (na ochranu vesmíru).
Metóda tesnenia: Konvenčné odstredivky používajú ploché alebo vyvýšené čiapky (na zabránenie odparovania a vysušenia). Avšak pre dlhé - skladovanie termínu sa odporúča tepelne - tesniaci film (napríklad parafilm) alebo priedušný film (napríklad Aeraseal) na vyváženie vnútorného a vonkajšieho tlaku. Dosky PCR sa odporúčajú používať lepiace fóliu hliníkovej fólie (vysoké - teplotu) alebo self - lepeného filmu (pre jednoduché {- použite).
Ochrana svetla: Reagenty obsahujúce svetlo - citlivé prísady (napríklad určité farbivá alebo priméry) by sa mali zabaliť do hliníkovej fólie alebo by sa mali použiť čierne dosky PCR (dostupné od niektorých výrobcov).
II. Alikvotné techniky: minimalizácia strát z opakovaného zmrazenia - cykly rozmrazovania
Alikvotné činidlá sú základným krokom v balení PCR a priamo ovplyvňuje experimentálnu reprodukovateľnosť.
Master Mix Alikoting: Komerčné hlavné zmesi (ako je Taq enzým a zmes DNTP) sa odporúča alikvotné alikvotné na základe reakčného objemu plus 5% - 10% okraj (napr. Pre 20 μl reakcie, aliquot 22 μl na trubicu). Vyhnite sa priamo z hromadného obalu, pretože opakované zmrazenie - cykly rozmrazu môžu viesť k zníženej aktivite enzýmov (enzým TAQ môže stratiť približne 5% aktivitu na cyklus zmrazenia a topenie).
Priméry a šablóny: Priméry (najmä vlastné priméry) sa odporúčajú alikvotné zo 100 μm zásobných roztokov a uložené pri - 20 stupňov. Pred použitím zriedite na pracovnú koncentráciu (zvyčajne 0,1–1 μm). Šablóny, ako je genomická DNA, by sa mali alikvotné v jednotlivých - používať množstvá na zabránenie krížovej kontaminácie.
TIPS prevencie kontaminácie: Zabezpečte, aby boli odstredivky suché pred alikvotom (zvyškový etanol môže inhibovať PCR), pred - Cool Pipette Hrots, aby sa zabránilo prilepeniu studených činidiel na stenu a nosiť rukavice počas celého procesu, aby sa zabránilo kontaminácii DNA kože.
III. Označovanie a vedenie záznamov: Vyhnite sa pascu „čiernej skrinky“
Čisté označovanie je rozhodujúce pre balenie PCR; Nesprávne označovanie môže zničiť celý experiment.
Informácie o povinnom označovaní: Názov činidla (napr. „2 × Taq Mastermix“), koncentrácia/obsah (napr. „10 mm DNTPS“), dávkové číslo (pre sledovateľnosť), podmienky skladovania (napr. „-20 stupňa chránené svetlom“), dátum alikvótov a platnosti (napr.
Špeciálne označovanie: Ak činidlo obsahuje glycerol (nemrznúca zmes), farbivá (napr. SYBR Green) alebo prísady (napr. BSA), musia sa poskytnúť ďalšie informácie (napr. „Obsahuje 50% glycerol, neskladujte pri vysokých teplotách“).
Synchronizácia záznamov: Odporúča sa použiť softvér na správu tabuľky alebo laboratórneho riadenia (napr. Labguru) na zaznamenanie podrobných parametrov obsahu každej trubice (napr. Primérová sekvencia, hodnota TM) a ich priradenie k číslu fyzického štítku.
Iv. Skladovanie a preprava: Vyváženie teploty a fyzickej ochrany
Stabilita reagencií PCR je vysoko závislá od podmienok skladovania a počas prepravy je potrebná ďalšia ochrana.
Všeobecné úložisko:
Enzýmy (taq, reverzná transkriptáza): dlhé - ukladanie termínu pri - 20 stupňov (vyhnite sa opakovaným cyklom zmrazenia a rozmrazenia; alikvot a uložte na -80 stupňa pre budúce použitie);
Priméry/sondy: Uložte na -20 stupňa viac ako 1 rok (ak obsahuje modifikovanú skupinu, ako je biotín, chráňte pred svetlom);
Non - Enzýmové vyrovnávacie pamäte (napr. PBS): Short - Termínske skladovanie pri 4 stupni (až 1 mesiac).
Požiadavky na dopravu:
Na prepravu studeného reťazca použite suchý ľad (- 78 stupňov) pre enzýmy (udržiavané pod -20 stupňom) a modrý ľad (okolo 0 stupňov) na nárazníky na krátkodobú prepravu.
Vyhnite sa nadmerným vibráciám (doštičky PCR by mali byť zabezpečené v penových škatuliach, aby sa zabránilo miešaniu činidiel medzi jamkami).
Počas vysokých letných teplôt pridajte do obalu izolačnú vrstvu (napr. Izolačná vrecko hliníkovej fólie + mrazené gélové balenie).
V. Bežné problémy a riešenia
Problém 1: Zrážanie činidiel (napr. DNTPS alebo MGCL₂ Zrážanie pri nízkych teplotách) → Riešenie: Stručne odstredivka (1 000 ot./min., 1 minúta) pred alikkotom. Pred použitím sa rozpustite v 37 -stupňovom inkubátore a Vortex na dôkladné premiešanie.
Problém 2: Tesnenie dosiek sa ľahko odlupujú → Riešenie: Vyberte tepelný - odolný tesniaci prostriedok s lepiacou podložkou alebo použite tepelný tesniaci prostriedok (vhodný pre vysoké - priepustné experimenty).
Problém 3: Rozmazané štítky → Riešenie: Použite vodotesný marker (napríklad Sharpie) alebo laser - tlačové štítky, aby ste zabránili vymazaniu rukopisu alkoholom.
Záver
Balenie PCR je viac ako len „balenie“; Je to prvá obranná línia pre experimentálnu spoľahlivosť. Výberom vhodných materiálov, štandardizácie procesu alikvotu, udržiavaním dôkladného označovania a udržiavaním prísnej regulácie teploty počas transportu môžete významne znížiť ľudskú chybu a zaistiť stabilnejšie následné amplifikačné reakcie a spoľahlivejšie výsledky. Pamätajte: Podrobnosti určujú úspech. Správne postupy balenia PCR môžu ušetriť značné riešenie problémov počas celého experimentu!